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          尾氣在線檢測分析在發酵中的應用

          時間:2018-04-17  來源:山東省科學院生物研究所  作者:sws2605384  瀏覽次數:13316
           

          原文已發表在《發酵科技通訊》2012.10,第414P32-35

          尾氣在線檢測分析在發酵中的應用

          劉仲匯,史建國,朱思榮,揚艷,高廣恒,李雪梅

          山東省科學院生物研究所,山東省生物傳感器重點實驗室,山東濟南,250014

          摘要:通過尾氣在線檢測分析可獲取發酵過程重要的呼吸代謝參數CER,OUR,RQ等。這些參數反映了微生物的代謝狀況,無論對動力學研究還是優化工藝、全面控制發酵過程、提高產量產率都具有重大意義。本文綜合論述了其在發酵各方面的應用。

          關鍵詞:發酵;尾氣; CO2;O2;CER;OUR;RQ

          0 引言

          發酵中尾氣組分濃度變化反映了整個發酵過程物質的變化情況。特別是尾氣中CO2和O2的變化,包含了非常有價值的過程反應信息。CO2是細胞呼吸和分解代謝的終產物,還是某些合成代謝的基質。幾乎所有發酵均產生大量CO2。CO2的產生是一種重要的生長指標,特別適用于早期生長階段。在對數生長期CO2的釋放在一定條件下與細胞量成正比。監測CO2的生成是跟蹤生長活動的有效方法。氧是構成細胞本身及代謝產物的組分之一。對于好氧發酵,無論是基質的氧化、菌體的生長或是產物的代謝均需要大量的氧[1-2]。

          通過發酵尾氣中的CO2及O2在線檢測分析,可以獲取發酵過程重要的呼吸代謝參數,如CO2釋放速率(CER)、攝氧率(OUR)、呼吸商(RQ)等。這些參數反映了微生物的代謝狀況,尤其能提供從生長向生產過渡或主要基質間的代謝過渡指標。CO2釋放率(Carbon-dioxide Escape Rate ,CER)是指單位時間、單位體積發酵液細胞釋放的CO2量。攝氧率(Oxygen Uptake Rate, OUR)是指單位時間、單位體積發酵液細胞消耗的氧。OUR取決于菌體濃度,也與發酵液的營養成分、溶解氧水平、菌體的生長速率以及碳源的種類和濃度等因素有關。CER除以OUR所得的商稱為呼吸商(Respiratory Quotient,RQ)。呼吸商是各種碳源在發酵過程中代謝狀況的指示值。在碳源限制且供氧充分的情況下,各種碳源都趨向于完全氧化,呼吸商應接近于其理論值。而供氧不足時,碳源不完全氧化,可使呼吸商偏離理論值[3-5]。

          目前發酵尾氣CO2O2檢測分析技術已日臻成熟。其性能穩定,可靠性高,可實現連續在線檢測。因是從尾氣取氣分析,對發酵無任何影響;也無需高溫滅菌,故為其應用創造了有利條件。

          近年來,尾氣分析在發酵中的應用研究越來越廣泛深入。這些對于深入研究發酵過程機理,摸索、優化發酵工藝,全面控制發酵過程具有重大意義;尤其在基因工程、生物制藥領域,能夠大大加快新品研發及產業化,穩定生產,提高產率。

          1 發酵過程狀態識別

          微生物發酵是個復雜的生化過程。在宏觀上表現為整個發酵過程的有規律性,即一般都經過遲滯期、對數生長期、穩定期和衰亡期。然而由于諸多因素的影響,又使各個發酵階段與具體的時間關系表現為無規律性。這給發酵過程的準確控制帶來困難。因此正確辨識發酵各個階段對于過程優化控制具有重要意義。

          研究表明,無論對于霉菌、酵母菌、細菌,單液相體系、雙液相體系,純種發酵、混合菌發酵,CER的變化與體系狀態的變化有著密切聯系,根據CER的變化規律可以有效、準確地把握發酵過程。李強等對青霉素、古龍酸、二元酸和葡萄糖酸發酵四個體系CER的變化規律進行研究,分析了CO2釋放與發酵各個階段的關系,證明CER用于過程判斷及控制是可行的[6]。李元廣等在十三碳烷烴生產十三碳二元酸發醉中發現隨著菌體生長,CER不斷增大,當菌體生長基本停止時,CER達到*大值,然后便開始下降。據此可以通過CER來及時確定進入產酸期的*佳時間,即CER達到*大值時[7]。

          楊強大等利用在線檢測OUR對特定發酵階段的比生長率進行預估,再利用預估值進行發酵階段的在線辨識,并應用于100L諾西肽發酵。依據辨識得到的發酵階段為0~13h為延遲期, 13~38 h為指數生長期,38 h以后為穩定期。該結果與實際過程相一致。這種估計方法無延遲,非常適合在線應用[8]。

          間歇發酵放罐時機的準確識別對提高產量和產率,降低能耗和成本有實際意義。傅春生等利用在線檢測的尾氣CO2變化率、DO變化率,輔以離線檢測的總糖濃度變化率、氨基氮濃度變化率及pH,并根據某抗生素生產數據,建立了該發酵過程放罐時機識別與預報模型及計算機實時識別系統。5批實驗表明模型判斷比人工更及時,且模型判斷的產量對于發酵終點的相對值高于人工判斷[9]。

          安居白等依據尾氣CO2、O2DO等在線參數,運用Bayes數據融合計算菌體生長狀態概率,建立了在線識別菌體生長狀態的檸檬酸發酵控制專家系統,在1.5 m3試驗罐上提高產物對底物的比近十個百分點[10]。

          2 優化供氧

          對于好氧發酵,為確保生產菌獲得適量的溶氧,將溶氧控制在臨界氧濃度之上即可。這樣既避免了細胞因供氧不足發生代謝異常,也可避免過度供氧引起的能量消耗和對細胞可能的傷害。根據OUR的變化可以很方便確定臨界氧濃度。其原理是:當發酵罐在一定操作系統下,體積傳氧系數Kla保持恒定時,隨著OUR上升,DO呈下降趨勢,當OUR下降,則DO上升,OUR與DO存在相反的變化趨勢。而當DO降到臨界氧濃度以下時,OUR隨DO的下降而下降。由于發生在此變化的時間內,菌體濃度變化可忽略,OUR的變化可看做是呼吸強度(即比耗氧速率)的變化。所以如果存在OUR與DO變化一致的階段,即為溶解氧低于臨界值的階段,從而可確定此時的臨界氧水平。

          戴劍漉等在30L發酵罐上研究了必特螺旋霉素基因工程菌發酵中OUR、CER及DO等參數變化的相關性,發現當DO與OUR的趨勢具有相反性時,限制因素為細胞水平的菌體代謝問題;若DO與OUR的趨勢具有同一性, 限制性因素為工程水平的氧傳遞因素,表明溶氧處于臨界氧以下;并據此判斷發酵前期臨界氧濃度應在25%,為其發酵放大工藝研究提供了依據[11]。

          通氣量的調節很多是憑借經驗。在安裝溶氧電極時可根據臨界氧來調控。諶頡在阿維菌素發酵中用尾氣數據進行通氣量控制,發現在產素期當通氣量由1600 m3/h降到1400 m3/h時,CER、OUR立即開始下降,RQ則是先升后降,說明供氧對代謝的限制已經顯現。后來測定的產素速率也在此時下降。以此確定產素期通氣量臨界值為1600 m3/h[12]。

          3 指導流加補料

          流加發酵可在系統中維持很低的基質濃度,從而避免發生阻遏效應,并按設備能力維持適當供氧,減緩代謝有害物的不利影響。因而可對發酵過程進行控制,提高生產水平。利用尾氣在線檢測分析可以合理控制流加時間、流加速率,進而實現流加的反饋控制。

             Cooney曾基于CO2總釋放量的積分,推導出精確的菌體量,據此來控制糖的流加速率[13]。

          陳冠勝等根據多批青霉素生產測得的CER, 采用模糊控制技術,在青霉素生產期將CER作為控制參數進行補糖。該控制算法能針對菌絲的瞬間代謝情況流加糖,使菌絲對糖的利用能力大大加強,效率提高了10%左右[14]。

             固定化酵母發酵中,載體的存在使葡萄糖擴散受阻。如不能對糖濃度變化快速反應,載體中的細胞就會出現缺糖現象。這種體系的特殊性也很難用估計糖濃度的方法來進行預測。潘小飛利用CER和CO2釋放量來估計載體內菌體對糖的饑飽程度,從而控制葡萄糖流加速率,使乙醇連續平穩地生產,平均轉化率為0.42g乙醇/g葡萄糖[15]。

          生物量預測及預估

          CER是呼吸代謝參數,與生物生長有密切聯系,可用來估計生物質濃度和產物濃度。而且這種估計的是反應活性生物質濃度或產物濃度,排除了培養基固體成分和死細胞的干擾。K Gbewonyo等人在800 L反應器上,曾研究利用在線的CER數據估計前期的菌體生長量,并且取得良好的對應關系[16]. 姜長洪等在50 m3谷氨酸發酵罐上利用CER在線估算菌體量,并用實測數據進行校正,使估算值接近實際值,同時運用先進的過程控制策略,對谷氨酸發酵的主要參數進行控制,運行后糖酸轉化率穩定提高,產酸率提高1.5%[17]。

          Horiuchi等在大腸桿菌分批培養中,用尾氣CO2來估算細胞、葡萄糖、乙酸的濃度和比生長速率[18]。

          桑海峰等基于在線檢測OUR,提出了一種比生長率與生物量濃度的在線連續估計方法。在諾西肽發酵應用中,估計值與實驗值吻合度好[19]。

          固態發酵已廣泛應用于生物農藥、飼料等行業,但生物量的測定是面臨的問題。在液態發酵容易做到的生物量離線測定,在此也因無法使菌體與培養基分離難以獲得。利用CO2在線檢測是比較有效的方法。張潔等人在木霉T6固態發酵產淀粉酶及產木聚糖酶中,分別研究了CO2與淀粉酶及木聚糖酶活力的關系,發現尾氣中CO2濃度曲線與比淀粉酶活力曲線變化一致,且同時達到*大值;而木聚糖酶的合成與CO2含量之間存在滯后關系, CO2濃度在發酵26h達到*高值,木聚糖酶活力在39h才達峰值。說明尾氣CO2含量變化可以作為固態發酵某些產物合成的研究參數[20-21]。

          5 作為研究優化發酵工藝的手段

             尾氣檢測分析目前已經成為優化發酵工藝非常有效的手段。

          莊英萍等在50L發酵罐上進行梅嶺霉素的發酵過程研究,通過對OUR、CER、RQ及氧傳遞系數等進行在線檢測及相關分析,對原工藝不斷調整,實現了梅嶺霉素發酵的初步優化,使發酵效價從原來的150 u/ml提高到520u/ml,為實現其工業化規模生產奠定了基礎[22]。

             朱校適等在50L發酵罐上進行了克拉維酸發酵過程溫度控制優化試驗,分別將全程溫度控制在24℃、26℃、28℃。通過對發酵各階段的CER、OUR和RQ進行對比分析,發現溫度對棒狀鏈霉菌的生長和代謝有重要影響,降低對數生長期發酵溫度可明顯緩解前期供氧不足的矛盾,進而提出了發酵過程的變溫控制,使克拉維酸的產量由原來3950mg/L提高到4500mg/L,增產11.5%[23]。

          在谷氨酸發酵中,控制CO2固定反應與乙醛酸循環的比率,對谷氨酸的產率影響尤為關鍵。楊玉嶺等人試驗合理控制CO2排放量, 使CO2含量處于既維持菌體正常呼吸,又確保更多的CO2固定, 從而提高發酵轉化率。試驗結果,6m3罐將CO2控制在7~8%比不控制提高轉化率1.81%;75 m3罐控制在8~9%,提高轉化率1.4%[24]。

          6故障預判

          發酵過程周期長,投入大。特別是對于工業發酵,可以通過尾氣在線檢測參數較早發現異常,及時補救,將損失降至*低。

          諶頡在阿維菌素發酵中發現非正常批次OUR的特征:OUR明顯偏高,菌體快速生長階段出現的OUR首個峰值超過對照批次約25%,且在100 h前數值基本都高于正常批次20 mol/m3.h。而非正常批次的產素速率僅為對照批次的50%左右。這是由于呼吸強度過高,菌體初級代謝過旺,雖用于合成的原料增加,但出于競爭關系,*后進入合成途徑的反而減少,甚至因為初級代謝物的阻遏作用而完全抑制合成途徑,所以造成產素速率低下。這樣就可以通過前期的OUR及時發現問題,進行補救[25]。

          董傳亮等采用OUR、CER、轉速、氨水耗量及細胞濃度,構建成基于自我聯想神經網絡5-6-2-6-5的AANN網絡,進行故障診斷和故障處理,優化得到的AANN網絡可以對谷氨酸發酵進行及時、準確的故障預判,從而為排除故障、盡可能快地恢復發酵性能提供信息[26]。

          7幫助判斷是否染菌

          在線檢測CO2可以監視發酵過程是否染菌。姜長洪等對谷氨酸發酵過程的研究發現,在正常通風情況下,若CO2濃度迅速下降,說明發酵罐內污染了噬菌體;若CO2濃度不斷上升,超出正常規律,則有可能污染了雜菌[27]。

          8 結束語

          綜上所述,尾氣分析技術在發酵領域應用取得了可喜成就,相信隨著技術的進步,相關設備的普及,應用研究會更加深入,并進一步推動生物產業發展。

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